Khoa Công nghệ sinh học & CNTP
ngiencuucnsh
WEBSITE CÁC ĐƠN VỊ
Trang chủ Nghiên cứu Thông tin NCKH
28/07/2017 16:16 - Xem: 191

Giới thiệu một số phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất thiên nhiên

  1. Phương pháp đánh giá hoạt tính diệt tế bào ung thư

Phương pháp 1: Phương pháp MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazol brom)

Hoạt tính diệt tế bào ung thư của các hợp chất sẽ được xác định theo phương pháp MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-điphenyltetrazol brom). Ba dòng tế bào ung thư người dự kiến sẽ sử dụng là HL-60 (human acute promyeloid leukemia - ung thư máu), PC-3 (human prostate cancer - ung thư tuyến tiền liệt), SNU-C5 (human colon cancer - ung thư ruột kết) được nuôi cấy trong môi  trường RPMI  1640 bổ sung 10% huyết thanh phổi bò (fetal bovine serum) và penicillin/streptomycin (tương ứng 100 U/mL và 100 mg/mL) ở 37 °C trong môi trường 5 % CO2 được làm ẩm. Các tế bào phát triển theo cấp số nhân được sử dụng trong các thí nghiệm.

Phương pháp MTT được tiến hành như sau: Các dòng tế bào ung thư người (HL-60; 3 × 105 tế bào/mL, PC-3; 5 × 105 tế bào/mL, and SNU-C5; 1  ×  105 tế bào/mL) được xử lý trong 3 ngày với các hợp chất ở nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và 100 μM hoặc với các cặn chiết ở nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và 100 μg/mL. Sau  quá trình ủ, 0,1 mg (50 µL của dung dịch 2 mg/mL) MTT (Sigma, Saint Louis, MO, USA) được bổ sung vào mỗi giếng và các tế bào sau đo tiếp tục được ủ ở 37°C trong 4h. Các phiến được tiến hành ly tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và sau đó môi trường được loại bỏ một cách cẩn thận. Sau đó, dimetylsunfoxit (150 µL) được cho vào mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan. Các phiến được đọc ngay sau đó ở bước sóng 540 nm trên thiết bị đọc vi phiến (Amersham Pharmacia Biotech., USA). Tất cả các thí nghiệm đều  được tiến hành lặp lại 3 lần và giá trị trung bình được tính toán. Kết quả được biểu thị là phần trăm ức chế đã tạo ra sự giảm cường độ hấp phụ khi xử lý với các chất thử so sánh với đối chứng âm. Đường cong phụ thuộc nồng độ được xây dựng và nồng độ ức chế 50 phần trăm (IC50) được xác định cho các mẫu thử cũng như cho từng dòng tế bào. Giá trị IC50 < 100 µM với chất sạch và IC50 < 100 µg/ml với các cặn chiết được coi là có hoạt tính.

Phương pháp 2. Phương pháp của Monks thử độ độc tế bào in vitro

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks . Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (Optical Density - OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử (10 μL) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có 20, 4, 0,8 và 0,16 μg/mL.

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 μL môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 μL) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid - TCA.

Sau giai đoạn ủ trong tủ ấm CO2 tế bào được cố định vào đáy giếng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong vòng 1 giờ ở 37oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% axit axetic  rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.

- Cuối cùng, sử dụng dung dịch tris (hydroxymethyl)aminomethane 10 mM để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB thông qua phổ hấp thụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng làm chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10, 2, 0,4 và 0,08 μg/mL. DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve.

Phương pháp 3: Phương pháp WST-8 tại Viện Y học tự nhiên, Đại học Toyama, Nhật Bản

Ngoài ra, hoạt tính gây độc tế bào còn được thử nghiệm theo phương pháp WST-8 tại Viện Y học tự nhiên, Đại học Toyama, Nhật Bản:

Các dòng tế bào A549 (ung thư phổi), HeLa (ung thư cổ tử cung) và TIG- 3 (tế bào thường) được duy trì trong môi trường MEMα (Wako pure chemicals Ind. Ltd., Osaka, Japan); PANC-1 và PSN-1 (ung thư tuyến tụy) được bảo quản trong môi trường DMEM (Wako pure chemicals Ind., Ltd., Osaka, Japan). Các môi trường này được bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (Gibco BRL Products Gaithersburg, MD) và 1% dung dịch kháng sinh (Sigma- Aldrich Inc., St. Louis, U.S.A.). Tế bào phát triển theo cấp số nhân được thu thập và 2×103 tế bào trong 100 μL môi trường được đưa vào mỗi giếng của khay 96 giếng (Corning Inc., NY, U.S.A ). Sau khi ủ 24 giờ trong tủ ấm 5% CO2 ở 37oC để cố định tế bào, tế bào được xử lý với các nồng độ khác nhau của mẫu thử trong môi trường tương ứng của chúng (100 μL). Sau 72 giờ, môi trường được thay đổi 10% WST-8 và cuối cùng là đếm % tế bào sống sót bằng cách đo mật độ quang tại 450 nm. 5-Fluorouracil được dùng làm đối chứng dương.

  1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

Phương pháp 1

Những chủng vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người thường được sử dụng:

- Bacillus subtilis (ATCC 6633): Là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh.


- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): Cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng;

- Escherichia coli (ATCC 25922): Gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.


- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): Gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.


- Candida albicans (ATCC 10231): Là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.


- Lactobacillus fermentum (Lp B14): Gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.


- Enterococcus faecium (B650): Gram (+), vi khuẩn gây bệnh viêm đường tiết niệu, viêm ruột thừa, viêm màng trong tim, viêm màng não.

Cách tiến hành: Thực hiện dựa trên phương pháp vi định lượng trên môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).

- Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một dãy 05 nồng độ là 128 μg/ml, 32 μg/ml, 8μg/ml, 2μg/ml, 0,5μg/ml

- Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105CFU/ml khi tiến hành thử.

- Chuẩn bị mẫu đối chứng: mẫu đối chứng (+) kháng sinh được pha trong nước cất theo nồng độ 10mg/ml và khử trùng bằng màng lọc Millipore 0,22μm; tiến hành các bước thì nghiệm tiếp theo tương tự như các chất thử khác. Mẫu đối chứng (-) chất thử được thay thế bằng nước cất vô trùng.

- Sau 24h đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.

- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ bước sóng λ = 492nm và phần mềm xử lý chuyên dụng.

Thí nghiệm được lặp lại với n = 3.

Phương pháp 2. Thử hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch

Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al. (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường LB đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường LB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 37oC . Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200 μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LB đặc, để khô và đục 5-6 giếng, đường kính khoảng 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2-3 cm. Chuẩn bị dịch chiết thử bằng cách hòa tan cặn chiết methanol của các mẫu thực vật trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO) thành các nồng độ theo yêu cầu. Bổ sung 50 μL dịch chiết thử vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 2 tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn; sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin 0,1 mg/ml với E. coliP. mirabillis; Kanamycin 5 mg/ml với S. aureusP. vulgaris); đối chứng âm là DMSO. Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức: BK (mm) = D-d; trong đó D = đường kính vòng vô khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch. Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình.

 3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa

Phương pháp 1. Thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH)

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH). Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela et al. (2003)  . Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống ôxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm.

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC ≥ 50%) sẽ được thử nghiệm để tìm giá trị SC50. Giá trị SC50 được xác định thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất thử.

Phương pháp 2. Dựa vào năng lượng khử

Năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Nhiều thể tích khác nhau của dịch chiết được trộn với đệm phosphate pH = 6,6 để đạt thể tích cuối cùng 1,5ml trước khi thêm 0,5 ml K3(Fe[CN3]) 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50oC trong 20 phút, sau đó thêm 0,5ml TCA 10% và 2 ml nước cất, cuối cùng 0,4ml AlCl3 0,1% được thêm vào. Độ hấp thu quang học được xác định tại bước sóng 700nm. Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh. Kết quả được tính toán bởi giá trị IC50, là lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,50.

Phương pháp 3. Xác định khả năng chống oxi hóa trên mô hình dầu - nước

Hệ nhũ tương dầu - nước được chuẩn bị gồm: 10% dầu Olive, 85% nước và 0,5% Tween 40. Hỗn hợp được đồng hóa ở tốc độ 10.000 rpm trong 5 phút (IKA, T18B, Ultra - Turax, Germany). Chính xác 2ml dịch chiết được trộn đều với 10ml hệ nhũ tương dầu – nước chứa trong ống nhựa 50 ml có nắp đật, đặt trong tủ ổn nhiệt ở  50oC, quá trình oxi hoá chất béo được quan sát hàng ngày. Hàm lượng hydroperoxide được xác định theo phương pháp của Richards và Hultin (2002). Hàm lượng hydroperoxide được xác định trên dịch chiết chất béo theo phương pháp của Bligh and Dyer (1959). Kết quả tính toán hàm lượng hydroperoxide từ đường chuẩn Cumene hydroperoxide (HPO) nồng độ từ 0-120 nmol/ml.

Nguồn tham khảo:

Hồ Việt Đức, (2015),  Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Uvatia L. – Họ Na (Annonaceae), Luận án Tiến sĩ Hoá học.

Thiard Frank, Tất Tố Trinh, Nguyễn Thuỵ Vy, Nguyễn Hoài Nghĩa, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Nguyễn Thị Kim Phụng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương; (2008); Khảo sát hoạt tính ức chế tăng trưởng của các cây thuốc Việt Nam trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa; Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, tập 11, số 01 – 2008.

Phạm Thanh Loan, Trần Huy Thái, Phan Văn Kiệm, Hoàng Lê Tuấn Anh, Châu Văn Minh, Đỗ Thị Thảo, Trần Thị Sửu, (2013), Hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập từ cây cẩm lai (Dalbergia oliveri Gamble ex Prain); Tạp chí Sinh học 2013, 35(4):439-444.

Nguyễn Thị Diệu Thuần, (2015), Nghiên cứu thành phần hoá học và khảo sát hoạt tính sinh học của loài xáo leo (Paramignya Scandens (Griff.) Craib) ở Lâm Đồng, Luận án Tiến sĩ.

Trần Mỹ Linh, Vũ Hương Giang, Lê Quỳnh Liên, Nguyễn Tường Vân, Ninh Khắc Bản, Châu Văn Minh, (2013), Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định của một số loài thực vật ngập mặn tại vườn quốc gia Xuân Thuỷ, Nam Định, Tạp chí sinh học, 35(3): 342-347.

Tin bài: Đinh Thị Kim Hoa

Người duyệt: TS. Trần Văn Chí

Người đăng: Bùi Đình Lãm

CÁC BÀI VIẾT CÙNG CHUYÊN MỤC
Web các đơn vị
CNSH-CNTP
Đang online 7363
Hôm nay 17890
Hôm qua 20750
Tuần này 107300
Tuần trước 119713
Tháng này 1920417
Tháng trước 2010103
Tất cả 22527379

Lượt truy cập: 22527380

Đang online: 7363

Ngày hôm qua: 20750

online

Chào mừng bạn đến với hệ thống trả lời hỗ trợ trực tuyến.
Để liên hệ với các bộ phận xin vui lòng điền đầy đủ vào mẫu kết nối

Họ và tên


Địa chỉ Email


Yêu cầu hỗ trợ